为啥要学习使用高效液相色谱柱？
色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路，建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。
液相色谱柱的安装
1、液相色谱柱的结构：
（1）液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
（2）柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱：
多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：
主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10μm之间。
2、色谱柱的安装：
（1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
（2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如，条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0、1～0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。
液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
（1）最好使用流动相溶解样品；
（2）使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；
（3）使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质；
2、流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此，要求流动相具备以下的特点：
（1）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
（2）流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
（3）流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时，降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
（4）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应，如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
（5）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
（6）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、 流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mL/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如，使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
4、 流动相使用注意事项：
（1）由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
（2）对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
（3）含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
（4）流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
（5）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
液相色谱柱的保存
1、反向色谱柱实验后的保养：
使用缓冲液或含盐的流动相，实验完后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
2、长期保存色谱柱：
如，色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下，对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或硫柳汞)中，并将堵头堵上，储存温度最好是室温。
液相色谱柱的再生
因为，色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说是柱效的下降。
1、反向柱的再生：
依次采用20～30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90(V/V)，乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
2、正相柱的再生：
依次以20～30倍的色谱柱体积正己烷、异丙醇(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高)、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意以上溶剂必须严格脱水。
3、离子交换柱的再生：
长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降。用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
特别说明：
再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。再生时最好选择不具备在线脱气的独立泵送系统色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪器精密部件。
液相色谱柱常见问题分析与解决方案
1、使用一段时间后柱压过高：
解决方案：首先查看是否HPLC系统原因，排除系统原因后，原因基本是由于实验过程中杂质在柱中的累积。尽量完善操作条件，做完样品后要及时冲洗干净，如缓冲盐的流动相一定要用高比例的水溶液(如，90%)冲洗完全后再用有机相保存。
2、筛板堵塞与柱头塌陷：
解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，小心取下筛板，用5%左右的硝酸溶液超声处理20分钟左右，再用纯水超声20分钟左右，重新装入色谱柱。
3、色谱柱头的填料被样品污染：
解决方法：
如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
4、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出：
解决方法：
如确定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
注意事项：
1、无论何时，必须保证色谱柱柱床不干涸，尤其是进样检测和柱冲洗过程中不能让流动相长时间(30min以上)走空，否则易使色谱柱干涸且带入大量几乎无法排出的气泡，甚至导致柱床局部塌陷或中部开裂。
2、使用与保存时，严禁用力甩，绝对杜绝不小心猛烈撞击或高处掉落，否则，易导致柱床机械性损坏，则再无再生可能。
3、当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；
4、避免使用高粘度的溶剂作为流动相；
5、进样样品要全溶解；
6、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围；
7、每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；
8、每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；
9、若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。
