NADPH氧化酶（NAO）试剂盒
NADPH氧化酶(NAO)是一个典型的膜蛋白，催化 NADPH氧化生成 NADP+，并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病(GCD)，在植物中，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。
NADPH氧化酶(NAO)将 NADPH氧化为 NADP+的同时生成超氧阴离子(O2 .- )，接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂 DPI排除背景值。最终检测生成的有色物质在 450nm处的吸光值，即可计算得出 NAO酶活性大小。
试剂盒组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 | |
提取液 | 液体 60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体 0.25mL×1支 | -20℃保存 | 若凝固可放置室温或 25℃水浴溶解。 |
试剂二 | 液体 1mL×1支 | -20℃保存 | |
试剂三 | 粉体 mg×2支 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分别加 0.55mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂四 | 液体 1mL×1支 | -20℃保存 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
NADPH氧化酶(NAO)活性测定：
建议正式实验前选取 2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备
①组织样本：
取约 0.1g组织，加入 1mL提取液，在 4oC或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。4oC×12000rpm离心 10min，取上清作为待测液。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例进行提取
②细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500万细菌或细胞加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500～1000：1的比例进行提取。
③液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
①酶标仪预热 30min以上，设定温度 37℃，调节波长至 450nm。
②所有试剂解冻至室温(25℃)。
③在 96孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
提取液 | 150 | 145 |
| 试剂一 | 5 | |
| 37℃孵育 5min(可能会产生沉淀，但不影响后续测定) | ||
| 试剂二 | 10 | 10 |
| 试剂三 | 10 | 10 |
| 试剂四 | 10 | 10 |
| 37℃避光孵育 20min，于 450nm读取吸光值 A，ΔA=A测定-A对照。 | ||
【注】若△A的值在零附近，可以延长反应时间 T(如至 40min或更长)，则改变后的反应时间 T需代入公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。
NAO(△OD450/min/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=250×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。
NAO(△OD450/min/g鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=250×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每 1万个细菌或细胞每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。
NAO(△OD450/min/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.01÷T=0.5×ΔA
V---加入提取液体积，1mL；
V1---加入样本体积，0.02mL；
T---反应时间，20min；
W---样本质量，g；
500---细胞或细菌总数，万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；
建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。
