T7 RNA Polymerase定量检测试剂盒(酶联免疫法)
预期用途
本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫法检测T7 RNA Polymerase的残留。
检测原理
T7 RNA Polymerase (T7 RNA聚合酶 )为重组E.coli表达的噬菌体T7 DNA编码的蛋白，是一种高度特异性识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶可以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA或双链DNA模板链互补的RNA 。
本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫法 (夹心ELISA)检测T7 RNA Polymerase的含量，用抗T7 RNA Polymerase的单克隆抗体包被酶标板，形成固相抗体，向固相抗体微孔板中加入T7 RNA Polymerase校准品和待测样品，经过洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的酶标试剂，形成 “包被抗体 -抗原 -酶标检测抗体 ”复合物，经过洗涤后加入显色液显色，显色液在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色并在酸的作用下最终转化成黄色，颜色的深浅与样品中T7 RNA Polymerase的量呈正相关。
主要组成成分
| 组分 | 盖色 | DD3504-01 | |
| BOX1 | T7 RNA Polymerase校准品(8,000 ng/ml) | 红色 | 100 μl |
| BOX2 | 预制酶标板 (包被anti-T7 RNA Polymerase的单克隆抗体 ) | - | 12 × 8孔，96孔 |
| 样品稀释液 | - | 30 ml × 2 | |
| 浓缩洗涤液(20 ×) | - | 30 ml | |
| 酶标试剂稀释液 | - | 12 ml | |
| 酶标试剂(100 ×) | 透明 | 120 μl | |
| 显色液 | - | 12 ml | |
| 终止液 | - | 6 ml | |
| 封板膜 | - | 3张 | |
| 说明书 | - | 1册 |
说明：本试剂盒不可与其他商品化试剂盒混用。
需要但是未提供的试剂与耗材：
>去离子水或蒸馏水
>振荡器
>洗板机
>微量移液器与配套灭菌枪头
>恒温箱或水浴锅
>酶标仪
>加样槽
>吸水纸
储存条件及有效期
1、BOX1于-30 ～ -15℃储存，避免强光直射，有效期12个月；
BOX2于2 ～ 8℃储存，避免强光直射，有效期12个月。
2、包被条拆封使用后，应将剩余包被条密封，在2 ～ 8℃储存，在有效期内使用。
3、BOX 1使用后要及时放回到-30 ～ -15℃储存，避免反复冻融，在有效期内使用。
4、BOX 2其他组分使用后要及时放回到2 ～ 8℃条件，在有效期内使用。
5、产品批号及失效日期：见产品外包装标签。
检验方法
1、实验前准备
(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，校准品从冷冻环境中取出，放置室温(18 ～ 28℃)平衡至少 30 min。
(2)1 ×洗涤液配制：将浓缩洗涤液(20 ×)用去离子水或蒸馏水20倍稀释，混匀备用。例如30 ml浓缩洗涤液(20 ×)用570 ml去离子水或蒸馏水稀释。
(3)校准品的配制：取校准品原液(8,000 ng/ml)稀释100倍后为80 ng/ml的浓度，然后再稀释5倍为校准品的第一个点(16 ng/ml)，再2倍倍比稀释成8、4、2、1、0.5 ng/ml。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新配制的校准品溶液。
▲标准品初次使用后请分装保存
| 移取 | 加入至 | 配成T7 RNA Polymerase校准品浓度 |
| 10 μl的8,000 ng/ml的校准品 | 990 μl的样品稀释液 | 80 ng/ml |
| 500 μl的80 ng/ml的校准品 | 800 μl的样品稀释液 | 16 ng/ml |
| 500 μl的16 ng/ml的校准品 | 500 μl的样品稀释液 | 8 ng/ml |
| 500 μl的8 ng/ml的校准品 | 500 μl的样品稀释液 | 4 ng/ml |
| 500 μl的4 ng/ml的校准品 | 500 μl的样品稀释液 | 2 ng/ml |
| 500 μl的2 ng/ml的校准品 | 500 μl的样品稀释液 | 1 ng/ml |
| 500 μl的1 ng/ml的校准品 | 500 μl的样品稀释液 | 0.5 ng/ml |
| 500 μl的样品稀释液 | 空管(对照孔) | 0 ng/ml |
(4)1 ×酶标试剂的配制：将酶标试剂(100 ×)用酶标试剂稀释液稀释成1 ×酶标试剂，根据检测数确定稀释体积(每孔100 μl)，例如检测整板，理论需要10 ml，实际配制11 ml 1 ×酶标试剂，其他情况根据所需检测数理论用量，增量10%配制。
2、实验步骤
(1)加样：先在酶标板中每孔加入100 μl样品/校准品。
▲待测样品需用样品稀释液至少稀释5倍。
(2)孵育：用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱孵育1 h。
(3)洗板：孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，每孔至少加入300 μl 1 ×洗涤液，静置浸泡30 s，连续洗板4次，最后一次尽量去除残留液体。
(4)加酶标试剂：以每孔100 μl加样量加入1 ×酶标试剂。
(5)重复步骤2、3。
(6)显色：按每孔100 μl加样量将显色液加入酶标板，用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱避光孵育15 min。
(7)终止/读值：每孔加入50 μl终止液，轻轻混匀后即可用酶标仪检测各孔在450 nm单波长处OD值。
简明操作程序
质量控制
检测时，校准曲线相关系数R2≥0.99，否则实验无效。
结果计算
(1)校准品和样品孔测得的OD值扣除对照孔的OD值用于结果计算。
(2)取以10为底校准品浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，采用四参数方式拟合绘制校准曲线。如有设置复孔，则应取其平均值计算。
(3)将样品的OD值扣除对照孔的OD值代入校准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。最低定量限(LOQ)=0.5 ng/ml，低于0.5 ng/ml报告为<0.5 ng/ml。若样品OD值高于校准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。此校准曲线仅用于示范，每次实验均应生成新的校准曲线。
产品性能指标
1、灵敏度
| LOD | LOQ |
| 100 pg/ml | 0.5 ng/ml |
2、精密度
| 分析内精密度 | 分析间精密度 | |||||
| 样品 | 批次1 | 批次2 | 批次3 | 操作者1 | 操作者2 | 操作者3 |
| n | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 平均值 | 2.3295 | 1.9380 | 1.8819 | 2.2142 | 2.1607 | 2.2902 |
| SD | 0.0827 | 0.0828 | 0.0394 | 0.1085 | 0.0721 | 0.1494 |
| CV | 4% | 4% | 2% | 5% | 3% | 7% |
3、回收率
| 样品(n=3) | 测得浓度平均(ng/ml) | 测得浓度平均(ng/ml) | 平均回收率% | 回收率范围% |
| 高 | 8.6875 | 9.0643 | 105 | 101 - 110 |
| 9.0066 | ||||
| 9.4987 | ||||
| 中 | 1.9855 | 2.0072 | 91 | 90 - 92 |
| 2.0027 | ||||
| 2.0334 | ||||
| 低 | 0.7118 | 0.7461 | 102 | 97 - 111 |
| 0.8122 | ||||
| 0.7144 |
注意事项
(1)操作前仔细阅读使用说明书，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。
(2)避免在恶劣的环境(如含有84消毒液、次氯酸钠、酸碱或乙醛等高浓度腐蚀性气体及灰尘的环境)条件下进行实验，实验室消毒应在实验结束后进行。
(3)试剂盒应平衡至室温下方可打开使用，试剂使用前应充分摇匀。各组分储存与用法请严格按照使用说明，切勿自行更改与稀释。在使用前，请严格检查试剂盒的效期与包装。如果效期超时或包装破损，请不要用于实验操作。试剂在有效期内使用后，剩余试剂要及时密封，参照说明书进行保存。
(4)预制酶标板可拆卸，每次将需用数量的板条取出后，其余未用板条须放回铝箔袋内于2 ～ 8℃储存待用。拆卸板条时，切勿碰触孔底，以免指纹、刮痕等影响之后的读值。洗板后，切勿放置太久避免酶标板干燥失活，需立即进行下一步操作。
(5)加样品时，避免产生气泡，避免枪头触及板底，造成刮痕影响读值。
(6)封板膜不可重复使用。不同批号的试剂组分不可混用，微量移液器枪头不可混用，以免交叉污染。
(7)若浓缩洗涤液出现结晶，应置于37℃中至溶解后再使用。洗涤时各孔需加满洗液，以防止孔口有残留试剂未被洗干净。洗涤要彻底。加液时不可用力过猛，避免串流。每次洗涤均应甩干孔内液体，最后应将孔内液体拍干(洗板推荐使用洗板机)。
(8)请在反应终止后15 min内进行。
(9)操作中须佩戴一次性手套和实验室规定的防护物品，检测后的废液和用具须按照当地政府和有关国家规定进行无害化处理。
(10)本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
